为何新冠病毒突变之后传染力更强？COVID-19 至今仍深深影响全人类，新冠病毒持续演化，例如曾经造成台湾大规模社区感染的 Alpha 变异株、传染力更强的 Delta 变异株，近期出现的 Omicron 变异株等，它们逃避免疫系统的能力都不一样，关键就在不同的棘蛋白（spike protein）结构。“研之有物”专访中央研究院生物化学研究所徐尚德副研究员，他的团队陆续解析各种新冠病毒变异株的棘蛋白结构，不但能厘清新的突变带来的威胁，后续也可做为研发人造抗体的指引。
解析新型冠状病毒棘蛋白
COVID-19 的病原体是一种冠状病毒，和 SARS 病毒是近亲，正式命名为 SARS-CoV-2，中文常称做新型冠状病毒。为了知道病毒如何感染人体细胞，以及如何逃避免疫系统的辨识，我们需要进一步了解冠状病毒表面的棘蛋白结构。
结构为什么重要？因为结构会影响蛋白质功能。蛋白质是由不同的氨基酸所组成的长炼，实际作用时会折叠形成特别立体结构，而冠状病毒的蛋白质中，又以棘蛋白最为关键。
徐尚德强调，棘蛋白是冠状病毒暴露在表面的蛋白质之一，绝大多数被感染者的免疫系统所产生的抗体都是辨识棘蛋白。因此现今临床使用的蛋白质次单元疫苗、腺病毒疫苗以及 mRNA 疫苗，都是以棘蛋白为基础来研发。
▲ 徐尚德手上拿着新冠病毒的棘蛋白模型，显示棘蛋白与两种不同抗体结合的情况。
Cryo-EM 让蛋白质结构无所遁形
工欲善其事，必先利其器。解析蛋白质结构的方法很多，早期的 X 光晶体绕射（X-ray diffraction），就像将影片定格截图，但不一定为蛋白质实际作用的状态。
再来是核磁共振（Nuclear Magnetic Resonanc，简称 NMR），这是徐尚德留学深造时的专业，可以重现蛋白质在水溶液中的结构及动态，更接近实际作用的形态，可惜不适合分子量较大的分子。
目前结构生物学最具潜力的新技术是：冷冻电子显微镜（Cryogenic Electron Microscopy，简称 Cryo-EM），Cryo-EM 可以拍出原子尺度下高分辨率的三维结构，此技术于 2017 年获得诺贝尔化学奖。中研院则于 2018 年开始添购 Cryo-EM 设备，而 Cryo-EM 正是徐尚德用来解析棘蛋白结构的主要利器！
在 COVID-19 疫情爆发初期（2020年1月），徐尚德就率先启动新冠病毒的结构分析，当时他的研究团队刚好已分析过感染猫科动物的冠状病毒，对于解析棘蛋白结构有一定经验，可说是赢得先机。
具体来说，如何用 Cryo-EM 解析新冠病毒的棘蛋白结构？
首先要大量培养新冠病毒、再分离、纯化得到棘蛋白。接下来，将大量蛋白质样本铺成薄薄一层液体，之后以 -190℃ 急速冷冻，让蛋白质分子保持冻结前的形态，最后用程式重建棘蛋白的三维影像。徐尚德譬喻，就像一匹马在高速移动时，连续拍摄许多照片，再将照片叠加起来，重建马的形状。
棘蛋白的体积已经算大，假如又与其他蛋白质结合，体积将会更大。能解析如此庞大结构为 Cryo-EM 一大优点，但是也会创造很大的资料量。徐尚德强调，用 Cryo-EM 分析蛋白质结构不只做实验，也要协调资料处理等疑难杂症。
▲ 冷冻电子显微镜可以记录同一时间下、不同状态的蛋白质三维立体结构。
关键 D614G 突变，让新冠病毒棘蛋白稳定性大增
尽管已有猫冠状病毒的经验，徐尚德研究团队初期仍经历一阵摸索，一大困难在于，做实验时发现不少棘蛋白坏掉，不再保持原本的结构。
这是因为一般取得蛋白质样本后会置于 4°C 冷藏，但 4°C 其实不适合保存棘蛋白。接着徐尚德细心观察到，具备 D614G 突变的棘蛋白，保存期限竟然比没突变的棘蛋白要长，可以从 1 天增加到至少 1 周。
什么是 D614G 突变呢？武汉爆发 COVID-19 疫情的初版新冠病毒，其棘蛋白全长超过 1200 个氨基酸，D614G 突变的意思就是：第 614 号氨基酸由天门冬胺酸（aspartic acid，缩写为 D）变成甘胺酸（glycine，缩写为 G）。
D614G 突变诞生后，存在感持续上升，2020 年 6 月时已经成为全世界的主流，随后新冠病毒 Alpha、Delta 等变异株，皆建立于 D614G 的基础上。
尽管序列仅有微小差异，许多证据指出 D614G 突变会增加新冠病毒的传染力。有趣的是，它也能大幅增加棘蛋白在体外的稳定性。因此在研究用途上，变种病毒的棘蛋白反而容易保存，徐尚德更指出，对抗变种病毒的蛋白质次单元疫苗（subunit vaccine）稳定性也会增加。
▲ 徐尚德实验室提供的新冠病毒模型与三种不同的棘蛋白模型，棘蛋白的主体为白色，棘蛋白的受器结合区域（receptor binding domain，RBD）为蓝绿色。
新冠病毒棘蛋白的“三只爪子”：受器结合区域
徐尚德参与的一系列新冠病毒结构研究，除了棘蛋白本身，还包含棘蛋白与细胞受器 ACE2 的结合、棘蛋白和人造抗体的结合。
既然要解析结构，仪器“分辨率”能看清楚多小的尺度就很重要！蛋白质结构学的常见单位是 Å（10-10 米），原子与原子间的距离约为 2 Å，Cryo-EM 的极限将近 1 Å，不过棘蛋白大约到 3 Å 便足以重建立体结构。
冠状病毒如何感染宿主细胞，和结构又有什么关系？棘蛋白位于冠状病毒的表面，直接接触宿主细胞受器 ACE2 的部分，称为受器结合区域（receptor binding domain，简称 RBD），结构可能展现“向上”（RBD-up）或是“向下”（RBD-down）的状态。向下，RBD 便不会接触宿主细胞的受器，缺乏感染能力；向上，RBD 方能结合受器，引发后续入侵。
▲ 徐尚德团队透过冷冻电子显微镜，拍摄新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白结构，其中有三类棘蛋白的 RBD 为 1 个向上（占 73%），有一类（类别3）的棘蛋白 RBD 则是 2 个向上（占 27%）。（Source：Nature Structural & Molecular Biology）
新冠病毒表面的棘蛋白有“三只爪子”（3 RBD），RBD 有可能同时向上（3 RBD-up），也可能只有 1~2 个向上，结构会影响病毒的感染能力。更详细地说，棘蛋白某些氨基酸位置的差异，会影响结构的开放与封闭程度。
棘蛋白向上或向下是动态的，假如能保持稳定性，延长向上的时间，也有助于新冠病毒的感染。这正是徐尚德一系列研究下来，实际观察到不同品系的变化。
▲ 截至 2022 年 01 月 18 日的新冠病毒品系发展历史，其中 Delta 变异株拥有最多品系，而 Omicron 变异株则开始兴起。虽然 Omicron 的品系并不多，但已逐渐成为主流。（Source：Nextstrain；GISAID）
一网打尽所有高关注变异株的结构变化
和武汉最初的新冠病毒相比，D614G 突变带来什么改变呢？简单说：棘蛋白向上的比例增加了，导致整个结构变得更加开放，增加新冠病毒对宿主受器的亲合力（affinity）。
以 D614G 为基础，接下来又独立衍生出数款品系，皆具备多个突变，传染力、抵抗力更强 。影响最大的是首先于英国现身的 Alpha（B.1.1.7）、南非的 Beta（B.1.351）、巴西的 Gamma（P.1），以及更晚几个月后，于印度诞生的 Kappa（B.167.1）与 Delta（B.167.2）。Alpha 一度于世界广传，导致包括台湾在内的严重疫情，不过随后不敌优势更大的 Delta。
对于上述品系，徐尚德率队一网打尽。 Alpha 的棘蛋白结构解析已经发表于 《自然－结构与分子生物学》（Nature Structural & Molecular Biology）期刊，其余新冠病毒变异株的论文仍在等待审查，目前能在预印网站 bioRxiv 看到，该研究一次报告 38 个 Cryo-EM 结构，刷新纪录。
▲ 图 a 显示新冠病毒 Alpha 变异株棘蛋白的突变氨基酸序列，一共有 9 处突变， D614G 突变以紫色表示。图 b 显示突变的氨基酸在立体结构中的位置。（Source：Nature Structural & Molecular Biology）
Alpha 变异株的 RBD 向上结构稳定
一度入侵台湾造成社区大规模感染的 Alpha 株有何优势？其棘蛋白除了 D614G，还多出 8 处氨基酸突变，徐尚德发现 N501Y（天门冬酰胺变成酪氨酸）、A570D（丙胺酸变成天门冬胺酸）的影响相当关键。
直觉地想，棘蛋白的外层结构才会与受器接触影响传染力，立体结构中第 570 号氨基酸的位置比较里面，乍看并不要紧。但是徐尚德敏锐地捕捉到，A570D 突变会改变局部的空间关系，令“RBD 向上”的结构更加稳定。徐尚德形容为“脚踏板”（pedal-bin）──A570D 突变的效果就像踩着垃圾桶的脚踏板，让桶盖（也就是 RBD）稳定保持开启。
事实上，棘蛋白总体向上的比例，Alpha 还比单纯的 D614G 突变株更少，不过 A570D 增进的稳定性似乎优势更大。研究团队制作缺乏 A570D 突变的人造模拟病毒，尝试体外感染人类细胞，发现感染力明显减少，证实 A570D 突变颇有贡献。
▲ 新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的“A570D 突变”，会改变棘蛋白内部的空间，让“RBD 向上”的结构更加稳定，就像踩着垃圾桶的脚踏板，让桶盖保持开启。（Source：徐尚德、Nature Structural & Molecular Biology）
Alpha 变异株的棘蛋白亲近宿主细胞，干扰抗体作用
另一个重要突变是 N501Y，不只 Alpha 有，Beta 等许多品系也有，Delta 则无。N501Y 在众多品系独立诞生，似乎为趋同演化所致。N501Y 能为病毒带来哪些优势？
第 501 号氨基酸位于棘蛋白表面，会直接与宿主受器 ACE2 结合。此一位置变成酪氨酸（tyrosine，缩写为 Y）后，和受器的 Y41 两个酪氨酸之间，容易形成苯环和苯环的“π–π stacking”键结，从而大幅提升棘蛋白对细胞的亲合力。
▲ 新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的“N501Y 突变”，让 RBD 的氨基酸与宿主细胞受器 ACE2 形成“π–π stacking”键结，大幅提升棘蛋白对宿主细胞的亲合力。（Source：Nature Structural & Molecular Biology）
另一方面，N501Y 突变也会干扰抗体的作用。中研院细胞与个体生物学研究所的吴汉忠特聘研究员，率队研发一批针对棘蛋白的人造抗体，测试发现有一款抗体 chAb25 对 D614G 突变株相当有效，但是对 Alpha 株无能为力。徐尚德由结构分析发现：N501Y 改变了棘蛋白表面的形状，让抗体 chAb25 无法附着。
好消息是，另外有两款抗体 chAb15、chAb45，依然能有效对抗 Alpha 病毒，不受 N501Y 影响。这两款抗体会附着在棘蛋白 RBD 的边缘，避免棘蛋白和宿主细胞接触。而且抗体 chAb15、chAb45 会各占一方，可以同时使用，多面协同打击病毒。
▲ 虽然新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白表面让某些抗体难以附着，还好仍有两款抗体 chAb15（绿色）、chAb45（黄色）能有效“卡住”棘蛋白，干扰棘蛋白与宿主细胞结合。抗体 chAb15、chAb45 附着的位置，正好就是棘蛋白与宿主细胞结合的地方。（Source：Nature Structural & Molecular Biology）
棘蛋白结构不只氨基酸，还要注意表面的糖
有了 Alpha 的经验，接下来分析 Beta、Gamma、Kappa、Delta 便顺手很多。这批新冠病毒的棘蛋白变化多端，但是“RBD 向上”的整体比例皆超过 Alpha 和 D614G 突变株，可见适应上各有巧妙。徐尚德也发现，要厘清棘蛋白的结构，不能只关心蛋白质，还要考虑棘蛋白表面的糖基化（glycosylation）修饰。
蛋白质在完工后，某些氨基酸还能加上各种糖基。病毒蛋白质表面的糖基可以做为防护罩，干扰抗体和免疫系统的辨识。糖基化修饰就像替病毒订做一套迷彩外衣，不同变异株的情况都不一样，假如糖基化的位置和数量，由于突变而改变，便有可能影响立体结构，有助于它们闪躲抗体。例如和武汉原版新冠病毒相比，Delta 株棘蛋白少了一个糖化修饰，Gamma 株棘蛋白则多了两处糖化。
还好从结构看来，并没有任何突变组合能完美逃避抗体。例如由美国的雷杰纳荣制药公司（Regeneron）制作并通过紧急使用授权的抗体；以及中研院吴汉忠率队研发，有望投入实用的多款人造抗体，对变异品系依然有效。这场人类与病毒的长期抗战中，同时使用多款抗体的“鸡尾酒”疗法，仍然是可行的医疗方案。
回顾将近两年来的研究之路，徐尚德表示：时间压力真的非常大！COVID-19 疫情爆发后，全世界投入相关研究的专家众多，只要稍有迟疑，便会落在竞争者后头。但是即使跑在最前端的研究者，也只能苦苦追赶病毒演化的速度，一篇论文还在审查时，现实世界的疫情已经迈向全新局面。
人类要赢得胜利，必需全方面认识病毒，而结构无疑是相当重要的一环。
（作者：寒波；本文由 研之有物 授权转载；首图来源：pixabay）
