中研院江安世院士、应用科学研究中心陈壁彰助研究员，共同开发了“透化层光定位显微镜”，一次解构果蝇全脑的多巴胺神经网络，并可“看见”记忆蛋白在特定神经细胞突触上的新生，此新技术可望揭开大脑记忆机制的神秘面纱。研究论文已于 2019 年 10 月 18 日刊登在《自然通讯》（Nature Communications）。
一个细微的动作、一丝情绪起伏，都是由千丝万缕的神经网络，以及大量讯息传递的化学分子交错作用的结果。早期心理学家要解析人类的大脑意识活动，必须对照研究对象的梦境和生活史。然而，大多数人一起床梦境就忘掉八成，还要将梦境和更久远的童年记忆连系起来，说佛洛伊德有多心累都不为过。
如今神经科学家有萤光蛋白与基因工程等工具在手，可先给予模式生物（如果蝇）特定刺激，然后用萤光定位脑内参与活动的生化分子（如某些与记忆有关的蛋白质分子），了解刺激前后分子如何重新分布，以此推测它们在脑部活动中所扮演的角色。BUT！因为可见光无法穿透较厚的组织，过去研究者只能将脑组织切成薄片，才能用显微镜观察。但切片会破坏大脑的整体性，无法忠实呈现完整的神经结构。
中研院院士、国立清华大学脑科学研究中心江安世，以及中研院应用科学研究中心助研究员陈壁彰，合作研发出可透视果蝇全脑的超解析 3D 层光定位显微镜，并利用化学方法把果蝇大脑变“透明”、可见光能通过，终于得以窥见果蝇脑部深处被萤光标定的单分子神经，借此建构果蝇全脑神经网络地图。2019 年团队借着这项技术，“看见”记忆蛋白在大脑深处特定神经细胞突触上的新生，初步揭开大脑记忆的神秘面纱。
精彩故事，是这么开始的……
分辨率、广度，统统都要
先来说说传统显微镜的问题！传统光学显微术能够解析的最小距离，大约 250 奈米左右。也就是说，如果两个发光分子之间的距离小于这个极限，因为光波的绕射特性会使分子影像变得模糊。这个鉴别距离极限，定义了光学成像的“分辨率”。
传统光学显微术的“绕射极限”，硬生生地限制了科学家一窥脑部全貌的梦想。
大脑神经突触的大小约在 20 到 40 奈米之间，与脑部分子活动相关的神经结构尺度也在数十奈米。可想而知，运用传统“粗线条”的光学显微术观察大脑，一定会有“见林不见树”的问题：即使可知大致的神经走向，也无法得知细微变化。但魔鬼，就是藏在细节里啊！
另一方面，传统显微镜还有视野广度或视野大小的问题。神经突触的大小是果蝇大脑（约数百微米）的数千分之一。想要解析特定分子在大脑的分布，困难度就像用小小无人机空拍一个篮球场，还要定位篮球场上每只蚂蚁的正确位置。
但在显微镜的世界里，分辨率和视野广度本是两个极端，想要一种技术、两种满足，必须找到非比寻常的解决之道。
关关难过关关过
首先，这种显微技术必须能够定位脑神经细胞中个别分子。衡量各种超解析显微术的优势与适用范围，“单分子定位显微术”（single molecule localization microscopy）具有数十奈米等级的空间分辨率，得以鉴别相距约 20 奈米的分子，恰好符合神经生物学家对分辨率的要求，无疑是首选工具。
再者，因为神经网络遍布全脑，并非仅局限在大脑的表层，此显微术必须能看得又深又清楚，才能重建果蝇大脑完整的三维影像，提供全面而精密的分子地图。近年热议的“层光显微术”（light-sheet microscopy）可快速取得大范围样品的影像，成为不二首选。
再加上，江安世院士团队透过生物组织澄清技术，运用化学方法让果蝇脑变透明、能让可见光通过，然后以层光扫描透明大脑，辅以上述单分子定位显微术，即可在短时间内侦测大脑内的个别分子位置，称为“透化层光定位显微镜”。
▲ 中研院应用科学研究中心陈壁彰助研究员与透化层光定位显微镜。（Source：中研院秘书处）
跨领域合作，打开大脑的潘朵拉盒子
有了既定的策略，抽象的概念立刻转化为一个跨界、甚至跨国的技术整合问题。
陈壁彰助研究员与江安世院士合作，将一个由国家实验研究院仪器科技中心打造的特殊显微物镜，整合入实验室既有的扫描式贝色层光显微镜（Scanning Bessel beam light-sheet microscope），建构出针对透明化样品最佳化的超解析显微镜，并应用日本东京大学 Yasuteru Urano 团队开发的新型闪烁萤光染剂 HMSiR 标定脑内分子，让每一个参与大脑记忆生成的分子，发出清晰且明亮的光讯号。论文第一作者、现任国立清华大学生医工程与环境科学系助理教授朱丽安兴奋地说：
身为一个生物学家，使用自己建造的显微镜系统，就像打开潘朵拉的盒子，突然什么都变成可能！
因为商用显微镜大多有镜头选用、分辨率等限制，尤其层光显微镜在镜头选择上更是有诸多限制。
那么，这项新的显微镜系统，会对神经科学带来什么改革呢？首先，神经讯号的传递仰赖神经突触电位及神经传导物质的传递，想要了解大脑的活动，必须解析突触上的细微变化，如蛋白质的生成。以模式生物果蝇为例，神经突触只有几百奈米，过去只能仰赖电子显微镜。但电子显微镜的样品制备非常繁复，并需要将组织切片，无法呈现完整的神经结构，一次能看的样品范围也很小。
电子显微镜的另一个问题是“很花时间”。美国珍利亚农场研究园区（Janelia Research Campus）所做的全果蝇脑电子显微镜连续切片影像，单一个果蝇脑就需花费 16 个月拍摄完成，再经过无数的工程师进行影像处理，不利于统计分析。
透化层光定位显微镜，可在比细胞大将近一万倍的组织（如果蝇大脑），定位其中所有蛋白质分子，进行果蝇全脑的摄影。而且全脑摄影可在一天之内完成，期间仅需移动样品 4 次，大幅降低机械移动造成的误差与后续影像处理的复杂性。与传统的显微技术比较，新技术能在合理的时间内拍摄大量样品，即时提供生物学家更大的统计样本。2019 年初已初步告捷！新的显微技术一次解构果蝇全脑的多巴胺神经网络，“看见”记忆蛋白在特定神经细胞突触上的新生，可望揭开大脑记忆机制的神秘面纱。
▲ 果蝇全脑多巴胺神经多尺度图像（上），细部的神经结构（左下），以及放大展现出非常复杂、但可经由新显微术辨识的神经网络（右下）。（Source：陈壁彰）
看见记忆、解密大脑疾病
昆虫脑部的蕈状体分布了一种囊泡单胺运转蛋白质（vesicular monoamine transporter），与昆虫的嗅觉与记忆功能息息相关，是一种在脑部负责讯息传递的重要分子。只要标定这种蛋白质分子的精确位置，即可从中归纳出与记忆有关的分子机制。
本次研究发现：在让果蝇进行特定的记忆训练后，只有特定的神经突触会增加囊泡单胺运转蛋白质表现，显示这些神经在记忆过程可能肩负重大功能。借由类似的实验，神经科学家可以厘清神经变化和特定脑部活动的关联，进一步理解神经在脑部记忆生成的机制，以及神经可塑性（placiticity）的变化，破解大脑记忆之谜。
▲ 左图是超解析之果蝇眼部单一神经，右图是超解析全脑囊泡单胺运转蛋白在神经上的分布。（Source：Nature）
另一方面，由于鼠脑被普遍使用于与人类脑部疾病有关的研究，未来江安世院士研究团队也计划以此探索老鼠脑，揭密与蛋白质分布有关的机制，对于解答部分人类脑部疾病做出贡献！
“目前为止，我们已经观察果蝇在训练前后的神经活动，并且能够分辨尺度在数十奈米左右的变化，这对厘清分子在神经可塑性中扮演的角色提供很大的帮助。”朱丽安期许未来：“十年后的目标是将影像分辨率提升到 10 奈米，并试着应用于活体，即时观察神经在脑部活动下的重塑，终极目标是理解学习行为的详细机制！”
也许不远的未来，新的显微技术可以观察生物学习当下发生的每一个细微脑部变化，解密人之所以为人，是如何从经验学习成长。
（作者：吕杰翰、黄钰珊、吕萱萱；本文由 研之有物 授权转载；首图来源：pixabay）
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